(一)何時須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素。
視細(xì)胞生長密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。
一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中可以添加抗生素。 按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。
(二)貼壁細(xì)胞傳代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應(yīng)處理
一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低,并可減少污染的機(jī)會.。
(三)將一般動物細(xì)胞離心下來,離心速率多少
回收動物細(xì)胞,其離心速率一般為 1 000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。
(四)細(xì)胞的接種密度
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。
(五)細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級
動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級,必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ,其本身即為無菌狀況,*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中避光保存。
(六)冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度
將貼壁細(xì)胞消化后離心收集,懸浮細(xì)胞直接離心收集,以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1~2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
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